Nijntje, Nina, Knorretje en Snuffie gaan op speurtocht door de dierentuin, op zoek naar een schat. Ze moeten daarvoor één voor één de vijf raadsels oplossen die vader en moeder Pluis hen geven.
Onderweg komen Nijntje en haar vriendjes allerlei dieren tegen en beleven ze met elkaar de leukste avonturen. De film is een spannende en vrolijke zoektocht langs de dieren, waar het publiek actief aan kan deelnemen. Nijntje speelt spelletjes, zingt liedjes en ontdekt op het eind een grote verrassing.
Nijntje vraagt de kijkertjes geregeld mee te helpen bij de speurtocht, en met alle leuke liedjes wordt de film een ervaring die kinderen keer op keer willen beleven.